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Cell:从结构上详细阐明单结构域骆驼抗体可强效中和包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2在内的β冠状病毒

来源:作者:人气:-发表时间:2020-04-29 13:10:00【

冠状病毒是一种有包膜的、正义RNA病毒,分为4个属(α、β、γ和δ),可感染多种宿主生物。至少有7种冠状病毒可引起人类疾病,其中4种病毒(HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-229E)在全球范围内季节性地在人群中流行,在大多数患者中引起轻度呼吸道疾病。剩下的三种病毒,即SARS-CoV(也称为SARS-CoV-1)、MERS-CoV和SARS-CoV-2,是人畜共患病的病原体,在人群中出现后,已经引起了流行病或大流行病,症状严重且往往是致命的。对于这些高致病性的β冠状病毒,预防性和治疗性的干预是需要的。
 Cell:从结构上详细阐明单结构域骆驼抗体可强效中和包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2在内的β冠状病毒

冠状病毒表面有刺突糖蛋白(S),它是一种大型I类融合蛋白。S蛋白形成了一个三聚体复合物,在功能上可分为两个不同的由一个蛋白酶切割位点分隔开的亚基,即S1和S2。S1亚基包含受体结合结构域(RBD),它与宿主细胞受体蛋白相互作用,触发膜融合。S2亚基包含膜融合复合物,包括疏水性融合肽和α-螺旋七肽重复区。SARS-CoV和MERS-CoV的功能性宿主细胞受体分别是血管紧张素转换酶2(ACE2)和二肽基肽酶4(DPP4)。无论是在结构上还是在生物物理学上,这些受体与各自的RBD之间的相互作用已经被充分地表征了。最近,有报道称SARS-CoV-2 S蛋白也利用ACE2作为功能性宿主细胞受体,并且已经报道了这种复合物的几种结构。

最近在低温电镜(cryo-EM)方面的进展使得科学家们能够确定这种三聚体刺突蛋白胞外域(ectodomain)的高分辨率结构,并了解S蛋白作为一种大分子机器的功能。对SARS-CoV刺突的初始低温电镜表征显示它的RBD至少采用了两种不同的构象。在 “向上(up)”构象中,RBD相对于S蛋白的其余部分向外突出,这样,它们可以很容易地与ACE2结合而不发生立体冲突。在“向下(down)”构象中,RBD紧紧贴着S2亚基的顶部,防止被ACE2结合。随后的实验证实了这一现象,并且在MERS-CoV S蛋白、SARS-CoV-2 S蛋白和α冠状病毒S蛋白中也观察到了类似的动态。由于在向上构象的三个RBD中,通过低温电镜可以观察到的颗粒丰度相对较低,因此有人认为这种构象可能对应于能量不稳定状态。这些观察结果让人们提出冠状病毒RBD可能作为分子棘轮发挥作用的假说:受体结合事件会将RBD保持在这种不太稳定的向下构象中,导致S1逐渐失去稳定,直到S2最终被触发而启动膜融合。最近的实验表明靶向RBD的抗SARS-CoV抗体让SARS-CoV RBD保持在这种向上构象中并导致它的融合前刺突失去稳定,从而为这一假说提供了支持。

人们已经报道了许多抗SARS-CoV RBD抗体和抗MERS-CoV RBD抗体,它们的中和机理可归因于受体结合位点的封闭和让RBD保持在这种不稳定的向上构象中,从而作为受体模拟物有效地触发融合前构象过早地转变到融合后构象。除常规抗体外,骆驼科动物还产生仅有重链的抗体(HCAb),其仅包含一个可变结构域(VHH)而不包含构成常规IgG抗体的抗原结合片段(Fab)的两个可变结构域(VH和VL)。在没有效应结构域的情况下,单个可变结构域被称为单结构域抗体、VHH或纳米抗体(Nanobody),通常可获得与常规抗体相当的抗原亲和力和特异性。VHH可以很容易地构建成多价形式,并且比大多数抗体具有更高的热稳定性和化学稳定性。此外,已知VHH对空间障碍的敏感性较小,而空间障碍可能会阻止较大的常规抗体结合。它们的优越的生物物理特性已导致评估了几种VHH抵抗呼吸道合胞病毒(RSV)等常见呼吸道病原体的疗效。

在呼吸道感染中将VHH用作生物制剂是一种特别有吸引力的应用,这是因为可以将高度稳定的VHH雾化并通过吸入器直接施用于感染部位。此外,由于VHH在长时间保存后仍保持稳定,可以将它们储存起来作为疫情爆发时的治疗选择。尽管迫切需要针对MERS-CoV和SARS-CoV-2的治疗方法,但尚未充分探讨为此目的使用VHH的可行性。已报道了通过对骆驼进行抗原免疫产生了几种靶向MERS-CoV S蛋白的VHH,但是它们的表位除了被归类为靶向RBD之外,在很大程度上仍然是未知的。

在一项新的研究中,来自比利时、美国和德国多家研究机构的研究人员分离出两种分别可强效中和SARS-CoV RBD和MERS-CoV RBD的VHH。这两种VHH分别是对美洲驼进行SARS-CoV S蛋白和MERS-CoV S蛋白免疫而触发的。他们解析出这两种VHH与它们各自的病毒表位形成复合物时的晶体结构,这表明中和机制可能是受体结合界面受到封闭和将RBD保持在向上构象中。相关研究结果以论文手稿的形式在线发表在Cell期刊上,论文标题为“Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-domain Camelid Antibodies”。 

这些研究人员还发现这种靶向SARS-CoV RBD的VHH与SARS-CoV-2 RBD发生交叉反应,并且可以阻断受体结合界面。在将这种VHH进行基因改造后成为二价Fc融合蛋白后,他们证实这种交叉反应性的VHH也可以中和携带SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒。他们进一步证实这种VHH-Fc融合蛋白可以在工业标准的CHO细胞系统中高产量产生,这表明作为正在进行的COVID-19大流行的潜在治疗试剂,它值得进一步研究。

由此可见,这些研究人员从接受融合前保持稳定的MERS-CoV和SARS-CoV S蛋白免疫的美洲驼中分离出两种具有强效中和能力的VHH,并对它们进行了表征。这两种VHH能够与各自S蛋白的RBD高亲和力地结合,能够在体外中和表达各自S蛋白的假病毒。就他们所知,人们之前还没有分离和表征SARS-CoV S蛋白特异性的VHH。几种MERS-CoV S蛋白特异性的VHH已经被描述,它们都是靶向RBD的。这几种VHH中的一些也已被报道可以阻断DPP4结合,非常类似于MERS VHH-55。通过解析出这两种新分离的VHH与各自的病毒靶点形成复合物时的晶体结构,他们提供了关于表位结合及其中和机制的详细见解。

人们已描述了一些靶向RBD的常规抗体能够中和SARS-CoV或MERS-CoV。MERS VHH-55的表位与一些靶向MERS-CoV RBD的抗体中的几种---包括C2、MCA1、m336、JC57-14、D12、4C2和MERS-27---的表位重叠。除了最近描述的也能结合SARS-CoV S蛋白和SARS-CoV-2 S蛋白的CR3022之外,SARS VHH-72的表位与任何之前描述的抗体的表位没有明显重叠。

然而,与SARS VHH-72不同,CR3022不能阻止ACE2结合,并且它缺乏中和SARS-CoV-2的活性。尽管表位部分重叠,但是这种功能上的差异可能是由于这两种抗体采用的接近角度不同。鉴于SARS VHH-72以纳摩尔解离常数(nanomolar KD)结合到SARS-CoV S RBD的一部分表现出较低变异的序列上,而且正如它与WIV1-CoV和SARS-CoV-2 RBD存在交叉反应性所证实的那样,它可能广泛地结合来自其他SARS-CoV样病毒的S蛋白。

这些研究人员表明,通过基因改造构建出二价VHH-72-Fc融合蛋白,他们可以补偿单价SARS VHH-72的相对较高的解离常数。这种二价分子在瞬时转染的ExpiCHO细胞中表达良好(~300 mg/L),并且能够在体外中和表达SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒。在未来利用现有的文库和SARS-CoV-2 S进行的筛选工作可能会产生更强的中和剂。

由于VHH内在的热稳定性和化学稳定性,它们已被研究作为一类潜在的治疗性药物来对抗多种疾病。之前已经报道了几种靶向HIV和流感病毒的VHH,并且有多种靶向RSV的VHH已经被评估。通过雾化喷雾给送这些分子的可能性在呼吸道病原体的情况下特别有吸引力,这是因为VHH理论上可以直接被吸入到感染部位,以最大限度地提高它们的生物利用度和功能。鉴于目前缺乏治疗MERS、SARS和COVID-19的方法,以及与冠状病毒疫情大爆发相关的破坏性影响,人们急需预防性和治疗性的干预措施。这些研究人员希望MERS VHH-55、SARS VHH-72和VHH-72-Fc因具有良好的生物物理特性和强大的中和能力,可以作为科学家们的有用试剂和潜在的候选治疗性药物。
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