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【外泌体纯化】新型亲和法外泌体提取试剂盒 ——MagCapture 外泌体提取试剂盒PS

来源:作者:人气:-发表时间:2019-11-07 10:31:00【
内毒素检测耗材
MagCapture™外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸(PS)亲和Tim4蛋白固化磁珠(PS亲和法)的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡(EVs)。如果想要得到更高纯度的外泌体,请使用10,000×g离心后的上清。西宝生物作为Wako指定国内经销商可提供外泌体研究整体解决方案,咨询请拨打400-021-8158
该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来,所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验,包括电镜分析(TEM)、纳米粒子追踪(NTA)分析、投喂实验、分子组成(蛋白质、脂质、核酸等)分析等。
膜表面磷酯酰丝氨酸(PS)亲和法
免疫系统中外泌体的组成分子
Tim4蛋白固化磁珠,在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸(PS),然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱,捕获高纯度的完整细胞外囊泡
优点 & 特色
使用新型亲和提取方法
  ● 通过PS亲和分子回收
  ● 低背景值
  ● 在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱
  ※ 可获得高纯度,完整的外泌体
无需进行超离
  ● 使用磁珠改进了操作
  ● 流程优化
  ※ 高重复性
与其他提取方法相比
方法
外囊泡纯度
囊泡状态
可操作性
回收量
PS亲和法
■■■
完整
简便稳定
■■■
超速离心法
■■
完整
简便
■■
聚合物沉淀法
完整
简便快捷
■■■■
密度梯度离心法
■■■■
完整
复杂
■■
抗体亲和法
■■■
不完整
简便稳定
■■
样品类型:细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。
  ● 可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡
  ● 可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡
  ● 重复性高,回收量稳定
  ● 简易操作(约3.5小时)
  ● 启用多个样品(无需超速离心)
产品列表
产品名称
包装规格
保存条件
MagCapture™Exosome Isolation Kit PS
10次
(产品编号:293-77601)
2次
(产品编号:299-77603)
2-10°C
试剂盒成分
(1)链霉亲和素磁珠
(2)生物素标记的外泌体捕获
(3)外泌体捕获免疫固定缓冲液
(4)外泌体结合增强剂(×500)
(5)洗涤缓冲液
(6)外泌体洗脱缓冲液
(7)反应管
<10 次>
 600 μL×1 管
 100 μL×1 管
 35 mL×1 瓶
 500 μL×1 管
 75 mL×2 瓶
 5 mL×1 瓶
 22 管
<2 次>
 120 μL×1 管
 20 μL×1 管
 7 mL×1 瓶
 100 μL×1 管
 1 mL×1 瓶
 1 管
*每套试剂盒能完成5次回收实验,即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit
案列*应用  
从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析
从人血清中提取外泌体的产量比较
使用该试剂盒,超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体,接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。
● 检测抗体
抗CD9兔多抗,System Bioscience公司
抗CD63兔多抗,System Bioscience公司
● 免疫印迹(WB)数据
从人EDTA血浆中提取外泌体
分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆(超滤更换缓冲液)、人血清中提取外泌体,进行WB检测(抗Flotillin2抗体)。
● 检测抗体
抗Flotillin-2小鼠单抗(29/Fotillin-2),BD Bioscience公司
● 使用样品量
各1mL
各样品结果分别对应150μL样品量。从100μL提取物中取出15μL,添加5μL的4×SDS样品缓冲液,全部上样。
从人尿液中提取外泌体的回收量比较
1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收,并做免疫印迹(WB)检测(抗CD9抗体)。
● 检测抗体
抗CD9兔多抗,System Biosciences公司
● 使用样品量
各1mL
● 免疫印迹(WB)数据
各样品结果分别对应150 μL尿液样品。从100 μL提取物中取出15 μL,加入5 μL的 4×SDS样品缓冲液,全部上样。
与传统沉淀法的功能比较实验:
分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562(人慢性骨髓性白血病)细胞培养上清(无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基)提取外泌体,分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】
按照试剂盒的操作说明(反应时间:3小时),从1 mL经过离心处理(10,000×g,30min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)中提取外泌体。
超速离心法
将10 mL经过离心处理(10,000×g,30 min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)进行超离(110,000×g,70 min),用TBS缓冲液重悬沉淀物后,再进行超离(110,000×g,70 min),回收沉淀部分。
聚合物沉淀法
从1mL经过离心处理(10,000×g,30 min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)中,按照市售的A公司产品的操作说明(静置时间:过夜)提取外泌体。
※1:110,000×g离心2小时,在不吸到沉淀的前提下回收上清。
比较提取的外泌体的透射电子显微镜(TEM)分析结果和纳米粒子追踪(NTA)分析结果
分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体,用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外,用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段(2~4×1010 particles),在透射电子显微镜进行分析。 
电子显微镜图像 数据提供:金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生
MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子,在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。
K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较(无血清培养基)
用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清(无血清培养基)获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法(CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体)进行实验。
*回收量,不是回收率
● 检测抗体
  抗CD63小鼠单抗(MEM-259)
  抗Flotillin-2 小鼠单抗(29/Flotillin-2),BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠单抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司
K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较(10%FBS-添加培养基)
用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒、超离法和聚合物沉淀法,从K562 细胞培养上清(10% 去外泌体 FBS补充培养基)获得样品进行电泳,用银染法和WB法(CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体)进行实验。同时,对外泌体提取片段进行质谱测定,比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例(由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的,所以人来源多肽的比率会下降)。
● 检测抗体
  抗CD63小鼠单抗(MEM-259)
  抗Flotillin-2小鼠单抗 (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠单抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司
  健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较
实验数据
①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量
通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离,然后使用microRNA提取试剂盒(产品编号295-71701)提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA,并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
相比超离法,PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。
②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较
运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离,然后使用microRNA提取试剂盒(产品编号295-71701)或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA,并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
对比AGPC法,使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA
外泌体蛋白质组学分析
<实验内容及结果>
分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法,从含10% FBS(不含外泌体)的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离,剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化,用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。
比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质
白色柱:源自外囊泡的人类蛋白质
灰色柱:来自FBS的牛蛋白污染物
红 色:来自外囊泡的标记蛋白
样品:K562细胞培养基(含有10%去除外泌体胎牛血清)
 
PS亲和法
超离法
聚合物沉淀法
1
71 kDa热休克同源蛋白
(Heat shock cognate 71kDa protein)
DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因
(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)
补体C3
(Complement C3)
2
膜联蛋白A6
(Annexin A6)
铁转蛋白受体1
(Transferrin receptor protein1)
α2-巨球蛋
(Alpha-2-macroglobulin)
3
铁转蛋白受体1
(Transferrin receptor protein1)
血清白蛋白
(Serum albumin)
纤连蛋白
(Fibronectin)
4
V-ATP酶A亚基
(V-type proton ATpase catalytic subunit A)
ATP依赖RNA解旋酶
(ATP-dependent RNA helicase A)
血清白蛋白
(Serum albumin)
5
浮舰蛋白-2
(Flotillin-2)
微管蛋白β5
(Tubulin beta-5 chain)
血小板反应蛋白-1
(Thrombospondin-1)
6
程序性细胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)
71 kDa热休克同源蛋白
(Heat shock cognate 71 kDa protein)
补体C4
(Complement C4)
7
细胞表面抗原4F2重链
(4F2 cell-surface antigen heavy chain )
脂肪酸合成酶
(Fatty acid synthase)
α-1抗蛋白酶
(Alpha-1-antiproteinase)
8
膜联蛋白A1
(Annexin A1)
细胞表面抗原4F2重链
(4F2 cell-surface antigen heavy chain)
载脂蛋白-β-100
(Apolipoprotein-β-100)
9
220kDa激酶D相互作用底物
(Kinase D-interacting substrate of 220kDa)
U5小核核糖核蛋白的解旋酶
(U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)
胎儿血红蛋白亚单位
(Hemoglobin fetal subunit beta)
10
膜联蛋白A2
(Annexin A2)
β4微管蛋白
(Tubulin beta-4B chain)
β5微管蛋白
(Tubulin beta-5 chain)
成对组合相关性比较
应用数据
Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度
Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸(BCA)定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒,是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为,碱性条件下的蛋白质Cu2+离子被还原为Cu+。Cu+与BCA形成络合物,即产生紫色螯合物,蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关,通过测定562 nm处的吸光度,并与标准曲线做比照,即可定量溶液中的蛋白质浓度。
利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体,通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。
【实验内容及结果】
将通过MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的25 μL外泌体溶液分注于96孔板中,加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200 μL。之后60℃孵育30分钟,检测560 nm吸光度(图1)。结果表明,通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测,可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测
由于外泌体蛋白质浓度相当低,因此BCA测定时不要稀释样品。
① 将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL和空白对照,分别每孔25 μL加到96孔板中。
② 分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液(空白)按照每孔25 μL加入96孔板。
③ 把200μL Protein Assay BCA Kit(产品编号:297-73101)的试剂A盒试剂B混合液(A:B=50:1)加入放有样品的孔板中。
④ 60℃孵育30分钟
⑤ 室温条件下降低孔板温度
⑥ 测定560 nm的吸光度
产品编号
产品名称
包装
订购热线:400-021-8158
297-73101
Protein Assay BCA Kit
蛋白测定试剂盒(二喹啉甲酸)
250次用
015-25613
2mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum
2mg/mL 牛血清蛋白溶液
1 mL×10
外泌体的标记和Hela细胞导入实验
【实验概要】
用PKH67(Sigma公司)标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡,Hela细胞导入确认
<外泌体PKH67标记>
1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体(实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体)
2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度
3. 将相当于5 μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5 mL管中。
*请配制合适的使用量
4. 将2.0 μL的PKH linker溶解在0.25 mL的DiluentC中。…4×Dye solution*
*请配制合适的使用量
5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中,混合后在室温中孵育5-10分钟。
6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns (MW 3000)(Thermo公司)。
7. 将100 μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中,离心(最大添加量:100 μL)。
*准备必需的支数。
8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中,24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。
*根据实验调节外泌体添加量

图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察
从16 mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4 mL培养上清液作为样品,通过PS亲和法提取外泌体。
● 提取的外泌体蛋白质浓度:22.3 ng/μL
● 粒子浓度:1.2×108 particles/mL
将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中,24小时后用荧光显微镜(左)和流式细胞仪(右)检测捕获情况。
Opti-MEM:取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。
细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作
样品预处理:对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体,则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。
下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作,请参考血清/血浆的实验步骤,做适当调整。
更换缓冲液(限制过滤)操作
用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。
1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20(100K)中。
2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20(100K)中,混匀。
3. 把第2. 的VivaSpin20(100K)在4℃下进行离心处理。
4. 减少上线的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 缓冲液。
5. 4℃下离心处理。
6. 减少上面的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 缓冲液。
7. 4℃下离心处理。
8. 减少上面的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加11 mL TBS 缓冲液。
9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。
10. 进行提取。
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤
MagCapture™ 外泌体产品
货号
品名
规格
咨询订购热线:400-021-8158
293-77601
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
Exosome外泌体提取试剂盒PS
10次用
299-77603
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
Exosome外泌体提取试剂盒PS
2次用
016-27061
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)
抗CD63单抗(3-13)
20ul
012-27063
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)
抗CD63单抗(3-13)
100ul
290-35591
Magnet Stand
MagCapture系列磁珠捕获用磁力架
1个
297-79201
PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD)
PS Capture™外泌体ELISA试剂盒(抗小鼠IgG POD)
96 次
297-79701
PS Capture™ Exosome Flow Cytometry Kit
PS Capture™外泌体流式试剂盒
300 次
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